20 Май 2011

Д-р Тео Шеттерс.

В результате исследований, проводимых в течение последних десятилетий, было установлено, что растворимый паразитарный антиген (SPA), типичный для нескольких видов Babesia, может быть использован в качестве основы вакцины, защищающей от клинических проявлений бабезиоза. Сначала SPA выделяли из плазмы крови инфицированных животных, однако со временем SPA был выделен из супернатантов культивированных in vitro паразитов. Испытания вакцинных препаратов против бабезиоза КРС и собак не всегда были успешными, что объясняется некоторыми отличиями антигенного состава отдельных видов бабезий. В данной статье изложены основные результаты научных разработок вакцин против бабезиоза собак, а также дополнительные исследования, направленные на усовершенствование SPA- вакцин против Babesia canis. 
 
История

Через семь лет после того, как румынский исследователь Виктор Бабеш впервые открыл роль паразита Babesia как этиологической причины гемоглобинурии коров, Babesia canis была выделена от собак в Италии [2]. Через семь лет после этого появились первые публикации, в которых описывались результаты первых экспериментальных  исследований, которые касались данного возбудителя [3]. Кроме детальных данных относительно морфологических и физиологических особенностей паразита значительное внимание уделялось аспектам формирования и возможности передачи иммунитета  среди собак при экспериментальном заражении. В частности, установлено, что в организме собак, которые переболели бабезиозом в условиях эксперимента, сохраняется незначительное количество паразитов, которое обеспечивает резистентность животных к реинвазии последующие 2-6 мес. как при условии внутривенного, так и подкожного введения инвазионного материала.
  Последующие исследования показали, что инъекция сыворотки крови реконвалесцентов способна предупредить инвазию у интактных животных при условии предварительного введения. Защитные свойства сыворотки  крови реконвалесцентов исчезали после 30-минутного прогревания при 56-57°С, однако сыворотка  крови нормальных собак, которые не переболели бабезиозом  вообще не имела защитных свойств.
   Интересные результаты были получены при работе с сывороткой крови
гипериммунизированных животных: оказалось, что образцы крови от животных , которые выжили после многократных экспериментальных заражений, не инактивируются при температурной обработке, т.е. даже после прогревания способны предупредить развитие инвазии у экспериментально зараженных животных при условии  введения на протяжении первых 48 часов после заражения. Очевидно, в сыворотке крови находился какой-то растворимый фактор защиты (возможно, антитела). Не менее важную роль в формировании защиты мог играть и комплемент, а как стало известно в дальнейшем, и натуральные киллеры и специфичные Т-хелперные клетки [4].

В поисках адекватного вакцинного антигена

Как установили Nocard и Motas, паразиты, выделенные от реконвалесцентов, при введении интактным собакам вызывали нелетальную форму бабезиоза с умеренным проявлением клинических признаков [3]. Это дало основание для получения живой аттенуированной вакцины, однако ее коммерческое производство не было налажено по следующим причинам: технические характеристики (короткий период хранения ) и недостаточное количество компаний, заинтересованных в данном продукте. Живые аттенуированные вакцины против бабезиоза КРС изготавливались некоторыми госструктурами [5]. Все перечисленное происходило до момента установления в сыворотке собак, зараженных Babesia canis, наличия растворимых паразитарных антигенов (SPA).
Как показали результаты иммунологических исследований, существуют как минимум два антигена, которые дают преципитацию с сывороткой крови реконвалесцентов. Дальнейшие серологические исследования показали четкую корреляцию между наличием антигенов в плазме крови и развитием заболевания [7]. Также установлено, что антитела, специфичные к этим антигенам, появляются в крови собак при переходе инвазии в латентную форму и регистрируются еще на протяжении 14 месяцев. Помимо этого, оказалось, что данные антигены защищают интактных животных от заражения  при условии введения их вместе с адъювантом [7].
  Самым удивительным является то, что антигены от разных  представителей Babesia оказались кросс-протективными (т.е. при иммунизации крыс антигенами, выделенным от зараженных собак, первые приобретали иммунитет против инвазии Babesia rodhaini) [7]. Последующие исследования дали возможность обнаружить более иммуногенный компонент (условно названый антигеном В) [8]. Это подтвердилось в опытах Sibinovic с антигенами Babesia rodhaini, который добился переноса пассивного иммунитета интактным крысам. Используя иммуноглобулины, специфические к антигену В, Babesia rodhaini [3], что дало основания считать антиген В наиболее пригодным для изготовления вакцины [9].

Разработка адекватной схемы производства вакцин.

  Определение вакцинного антигена было лишь частью успеха. Значительную проблему составляло коммерческое получение вакцинного антигена в большом количестве, поскольку получали его из сыворотки собак, пораженных Babesia canis. Значительным толчком стала разработка Trager и Jensen технологии культивирования in vitro другого паразита крови – возбудителя малярии Plasmodium falciparum [10]. Главными принципами данной технологии было создание СО2-атмосферы  и «подстилки» из статичной прослойки эритроцитов на дне лунок культуральной планшеты. Это было настоящим прорывом не только касательно малярии, но и в системе исследований бабезиоза. В результате была создана система долгосрочного культивирования Babesia bovis [11].Помимо СО2- атмосферы для культивирования возбудителя бабезиоза КРС использовалась система сниженного парциального давления кислорода в зоне пролиферации паразитов. На основании такой системы разработана схема  краткосрочного культивирования in vitro Babesia canis, что открыло путь для разработки коммерческой вакцины[ 12, 13].

Вакцина, основанная на антигене SPA BABESIA CANIS
 
Культивирование in vitro паразитов и В. Bigemina по разработанной схеме дало возможность наработать достаточное количество экспериментальной вакцины, которая прошла серию полевых исследований. Как показали результаты исследований, у коров, иммунизированных исследуемыми образцам препарата, при заражении  В. Bovis клинические проявления заболевания, а также уменьшение показателя гематокрита были маловыраженными в сравнении с контрольными (не вакцинированными) животными [14].
  Первая коммерческая SPA-вакцина, изготовлена на основании антигена, полученного при культивировании Babesia in vitro, содержала только SPA Babesia canis (штамм Villeurbanne, Франция) [12, 15]. Антигены обрабатывали формалином и лиофильно высушивали. Непосредственно перед введением вакцину разбавляли специальным растворителем, который содержал адъювант сапонин. Экспериментальных собак вакцинировали дважды с трехнедельным интервалом. Когда через три недели после бустерного введения вакцины проводили эксперементальное заражение животных, клинические признаки у них были маловыразительными – регистрировали лишь кратковременная гипертермия и незначительная анемия. Паразитемия наблюдалась, однако, на протяжении значительно меньшего времени, чем у животных контрольной группы (невакцинированных) [16, 17]. Значительно снизилась частота заболеваний бабезиозом среди вакцинированных животных – из 16% она стала практически нулевой, что наблюдали на протяжении трех лет! Учитывая то, что гуморальный иммунный ответ у собак развивается не только при условии вакцинации, но и после переболевания, отличить эффект природного инфицирования от эффекта вакцинации очень сложно.
Дальнейшие полевые опыты вакцины показали, что среди вакцинированных собак клинически выраженный бабезиоз встречался у 12,3% животных,  а среди неиммунизированных – 16.7%. Средний уровень защиты составил около 25%. Это достаточно невысокий показатель объяснялся значительными антигенными отличиями среди разных изолятов Babesia canis. Вакцины, изготовленные на основании  SPA какого-то определенного изолята Babesia canis, защищали только от гомологичного возбудителя, но не от гетерологичного [20]. Бустерная инъекция вакцины не отразилась на эффективности вакцинации [21]. Так, изоляты В. Canis, выделенные во Франции, были разделены на три антигенные группы, все они были полиморфными по двум генам [22]. Следовательно, использование SPA-вакцин, изготовленных на основании антигена определенного изолята, не обеспечивает высокий уровень защиты.

Исследования, Направленные на расширение защитного спектра SPA-вакцин.

Это направление является приоритетным в сфере борьбы с бабезиозом. В опытах с тропическим бабезиозом КРС удалось определить, что разные изоляты В.bovis отличались между собой по способности формировать гетерологическую защиту[23]. Для расширения спектра иммуногенности, целью вакцинации должна быть стимуляция иммунного ответа к эпитопам, присутствующим у разных изолятов В. canis. Так, собаки, которые переболели бабезиозом, вызванным Babesia rossi (большой представитель, распространенный в Южной Африке и очень похож на европейский  В. canis[24]), оказались нечувствительными к заражению изолятами  В. Canis во Франции [25]. Результаты использования SPA Babesia rossi как дополнительного компонента антигенного состава вакцины обнаружили высокую эффективность такого бивалентного препарата при заражении гетерологическими  изолятами Babesia [26]. Вероятно, установлена роль специфичных Т-клеток, которые стимулируют SPA заражающего изолята. Динамика атителопродукции после экспериментального заражения подтверждала состояние сенсибилизации собак антигеном SPA после предыдущей вакцинации [26]. Протективная активность вакцины при экспериментальном заражении Babesia canis не может быть обусловлена только SPA Babesia rossi [27, 28, 29].

Эффективность SPA-ВАКЦИН как средства профилактики бабезиоза собак.

• SPA, выделенные от зараженных собак

Как показали исследования Sibinovic с соавторами, нативные SPA, выделенные от больных собак, способны обеспечивать некоторую защиту при контрольном заражении. У таких животных не развивалась периферическая паразитемия и не отмечалось значительных изменений показателя гематокрита. После заражения  показатели гематокрита все же понижались, что сопровождалось накоплением преципитирующего SPA в плазме крови. Выздоровление животных происходило по мере специфической к SPA антителопродукции [7]. Поскольку SPA-специфические антитела регистрировались при отсутствии паразитов в периферической крови, депонирование бабезий наблюдали в микрососудах [ЗО, 31].

Когда нативные SPA Babesia canis были разделены на две фракции (А и В), то более иммуногенными оказались именно фракции В. Интересно, что антиген В вызывал снижение показателей гематокрита во время вакцинации. Поскольку наличие этого антигена сопровождалось анемией, было проведена серия исследований относительно влияния антигена В на гематокрит нормальных интактных  животных. При инъекции нативного антигена В В. Canis интактным крысам, показатель гематокрита у них снизились за 4 часа до 46,6% (±8,5%) от показателей нормы, а до нормальных показателей (98,3%) гематокрит восстановился за 4 дня. У опытных животных наблюдалась умеренная спленомегалия  (на 15-20%) на протяжении 120 часов после инъекции. Использование реакции иммунофлуоресценции дало возможность обнаружить слабую взаимосвязь антигена В с поверхностью нормальных эритроцитов, что свидетельствовало в пользу гипотезы про возможность разрушения эритроцитов как причины снижения гематокрита. Однако по результатам ранних экспериментов было установлено, что гемолиз и гемоглобинурия при инвазии В. Canis происходят за счет разрушения эритроцитов при выходе из них паразитов, а не за счет литической активности компонентов плазмы. Система кроветворения не способна восстановить нормальное количество эритроцитов за 4 дня. За один день возможно восстановление только 1,6% эритроцитов [33].Чрезмерное снижение гематокрита, которое не может быть результатом только пролиферации паразитов, может быть вызвано гипотензией и депонированием эритроцитов в селезенке [34]. Таким образом, установлено, что введение ан¬тигена В В. Canis вызывает реакцию по типу гипотензивного шока, что возможно только при некоторых системных инфекциях [35]. Считается, что антитела, которые продуцируются при вакцинации, могут нейтрализовать патологичную активность антигена В.

Культуральные SPA
 
Эффект вакцинации оценивается не только по количеству паразитов, но и по действию SPA в плазме крови. Для определения концентрации растворимого SPA Montealegre с соавторами предложили тест-систему на основе ИФА. Данная методика использовалась для детекции нативных SPA В. Canis у вакцинированных собак [37]. Результаты исследования показали, что, хотя паразитемя у вакцинированных не отличалась от такой у контрольных, уровень SPA в их плазме крови был значительно ниже. Более того, установлена негативная корреляция между постинфекционными концентрациями SPA  и показателями гематокрита у таких животных [37]. Оказалось, что SPA влечет за собой гипотензию, а введение вакцинного SPA, наоборот, ограничивало развитие гипотензии  вследствие антителопродукции (происходила нейтрализация патогенного эффекта SPA антителами). Следовательно, как врожденный, так и приобретенный иммунитет играют важную роль в формировании защитных механизмов против бабезиоза собак [3, 38].

Роль вакцинации SPA в защите против разных проявлений бабезиоза собак

Как уже упоминалось раньше, вызвать клинический бабезиоз у собак могут разные виды Babesia [29, 39]. В популяции животных, зараженных бабезиями, заболевание может иметь сверхострый, острое, хроническое  или даже бессимптомное течение[38, 40, 41].  Клиника заболевания может быть разнообразной на протяжении развития заболевания вследствие  каскада патогенетичных реакций со стороны организма инфицированного животного, которые далеко не всегда полезны для организма хозяина. Однако первичные процессы, которые запускают развитие клинического бабезиоза, очень похожи между собой у разных собак, и если воздействовать на эти первичные триггерные механизмы, то можно предупредить дальнейшее развитие клинических признаков.

Так, существует гипотеза, что вазодилятация у собак, пораженных В. canis, приводит к гипотензии и стазу, которые способствуют прилипанию эритроцитов к эндотелию сосудов[34]. Формируются ли среди пораженных В. Canis эритроцитов такие, которые афинны к эндотелиальным клеткам сосудов при инвазии В. bovis[34],неизвестно, однако хорошо известно, что при инвазии отдельным изолятами В. Canis эритроциты слипаются и агглютинируют[8, 34]. В любом случае локальное разрушение эритроцитов приводит к освобождению эритроцитарной стромы, которая имеет прокоагулирующие свойства, однако инициирует систему коагуляции только локально. Это приводит к кумуляции эритроцитов, часть из которых заражена.
Интенсивная локальная пролиферация паразитов приводит к увеличению количества пораженных клеток крови и развитию характерной картины закупорки микрососудов пораженными эритроцитами [31, 42, 43]. Дальнейшие клинические проявления  будут зависеть от того, микроциркуляция какого из органов будет больше нарушена[38]. Если будет поражено кровоснабжение головного мозга, есть высокая вероятность гибели животного от церебрального бабезиоза. Если прямого поражения какого-нибудь из жизненно важных органов не происходит, то у животного развивается циркуляторный шок, который сопровождается ДВС-синдромом (дисеминированное внутрисосудистое сворачивание крови) [38, 44, 45, 46].Предупреждение первичного вазодиляторного шока с помощью SPA может разорвать этот порочный круг событий и не допустить развития клинической картины бабезиоза.

 

Рис.1 Иммунитет против Babesia canis может передаваться животным – реципиентам при введении им сыворотки крови реконвалесцентов или гиперммунизированных собак-доноров, которые подтверждаются вероятно большим количеством животных, которые выжили при контрольном заражении  в опытной группе сравнительно с аналогичным показателем контроля. Собаки, которым вводили иммунную сыворотку крови, выжили при первом контрольном заражении, а потом были заражены повторно. При повторном заражении 25% животных погибло.

Литература:

1  Babes, V. (1888) Sur l'hemoglobinurie bacterienne du boeuf. C.R. Acad. Sci. Paris 107, 692-694
2 Piana, G.P. and Galli-Valerio, B. (1895) Su di un infezione del cane con parasiti endoglobulari. Il Moderno Zooiatro 6, 163-169
3 Nocard, E. and Motas, C. (1902) Contribution a l'etude de la piroplasmose canine. Ann. L'Institut Pasteur 16, 257-290
4 Brown, W.C. and Palmer, G.H. (1999) Designing blood-stage vaccines against Babesia bovis and B. bigemina. Parasitol. Today 15, 275-281
5 Vercruijsse, J. et al. (2004) Veterinary parasitic vaccines: pitfalls and future directions. Trends Parasitol. 20, 488-492
6 Sibinovic, K.H. et al. (1967) A study of some of the physical, chemical, and serologic properties of antigens from sera of horses, dogs, and rats with acute babesiosis. J. Parasitol. 53, 919-923
7 Sibinovic, K.H. et al. (1967) Immunogenic properties of babesial serum antigens. J. Parasitol. 53, 1121-1129
8 Sibinovic, K.H. et al. (1969) In vivo and in vitro effects of serum antigens of babesial infection and their antibodies on parasitized and normal erythrocytes. Ann. Trop. Med. Parasitol. 63, 327-336
9 Ristic, M. and Kakoma, I. (1988) Exoantigens ofBabesia. InBabesiosis of Domestic Animals and Man (Ristic, M., ed.), pp. 131-141, CRC Press
10 Trager, W. and Jensen, B. (1976) Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, 673-675
II Levy, M.G. and Ristic, M. (1980) Babesia bovis: continuous in vitro cultivation in microaerophilous stationary phase culture. Science 207, 1218-1220
12 Moreau, Y. and Soula, A. (1979) Babesia canis: la culture in vitro du parasite et son etude ultrastructurale. Bull. Soc. Sci. Vet. et Med. comparee. 81, 255-261
13 Molinar, E. et al. (1982) Antigenic and immunogenic studies on cell culture-derived Babesia canis. Vet. Parasitol. 10, 29-40
14 Montenegro-James, S. et al. (1989) Culture-derived Babesia exoanti¬gens as immunogens. In Veterinary Protozoan and Hemoparasite Vaccines (Wright, I.G., ed.), pp. 61-97, CRC Press
15 Moreau, Y. and Laurent, N. (1984) Antibabesial vaccination using antigens from cell cultures: industrial requirements. In Malaria and Babesiosis (Ristic, M. et al., eds), pp. 129-140, Martinus Nijhoff
16 Moreau, Y. et al. (1986) Immunologie-immunopathologie et essays d'immunoprevention de la piroplasmose canine. Prat. Med. et Chirurgicale Anim. Comp. 21, 85-95
17 Schetters, T.P. et al. (1994) Vaccination of dogs against Babesia canis infection using antigens from culture supernatants with emphasis on clinical babesiosis. Vet. Parasitol. 52, 219-233
18 Moreau, Y. et al. (1988) Epidemiologic and immunoprophylactic aspects of canine babesiosis in France. In Babesiosis of Domestic Animals and Man (Ristic, M., ed.), pp. 191-196, CRC Press
19 Schetters, T.P. and Montenegro-James, S. (1995) Vaccines against babesiosis using soluble parasite antigens. Parasitol. Today 11, 456-462
20 Schetters, T.H. et al. (1995) Strain variation limits protective activity of vaccines based on soluble Babesia canis antigens. Parasite Immunol. 17, 215-218
21 Schetters, T. et al. (1996) Vaccination of dogs with soluble Babesia canis antigens derived from in vitro culture is strain specific. Acta Parasitol. Turcica 20, 543-550
22 Carcy, B. et al. Genetic basis in GPI-anchor merozoite surface antigen polymorphism from Babesia and resulting antigenic diversity. Vet. Parasitol. (in press)
23 Ristic, M. and Montenegro-James, S. (1988) Immunization against Babesia. In Babesiosis of Domestic Animals and Man (Ristic, M., ed.), pp. 163-189, CRC Press
24 Carret, C. et al. (1999) Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes. J. Euk. Microbiol. 46, 298-303
25 Uilenberg, G. et al. (1989) Three groups ofBabesia canis distinguished and a proposal for nomenclature. Vet. Q. 11, 33-40
26 Schetters, T.P. et al. (2001) Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infection using antigens from culture supernatants. Vet. Parasitol. 100, 75-86
27 Lewis, B.D. et al. (1995) Immune responses to South African Babesia canis and the development of a preliminary vaccine. J. S. Afr. Vet. Assoc. 66, 61-65
28 Nuttall, G.H.F. (1904) Canine proplasmosis I. J. Hygiene 4, 219-252
29 Schetters, T.P. et al. (1997) Different Babesia canis isolates, different diseases. Parasitology 115, 485-493
30 Allred, D. (1995) Immune evasion by Babesia bovis and Plasmodium falciparum: cliff-dwellers of the parasite world. Parasitol. Today 11, 100-105
31 Schetters, T.P. et al. (1998) Parasite localization and dissemination in the Babesia-infected host. Ann. Trop. Med. Parasitol. 92, 513-519
32 Breinl, A. and Annett, H.E. (1909) Short note on the mechanism of haemolysis in Piroplasmosis canis. Ann. Trop. Med. Parasitol. 2, 383-385
33 Schalm, O.W. et al., eds (1975) Veterinary Hematology, p. 390, Lea & Febiger
34 Schetters, T.P. et al. (1997) Vaccination of dogs against Babesia canis infection. Vet. Parasitol. 73, 35-41
35 Wright, I.G. and Goodger, B.V. (1988) Pathogenesis of babesiosis. In Babesiosis ofDomestic Animals and Man (Ristic, M., ed.), pp. 99-118, CRC Press
36 Montealegre, F. et al. (1987) Detection of culture-derived Babesia bovis exoantigen using a two-site enzyme immunoassay. J. Clin. Microbiol. 25, 1648-1652
37 Schetters, T.P. et al. (1996) Not peripheral parasitaemia but the level of soluble antigen in plasma correlates with vaccine efficacy against Babesia canis. Parasite Immunol. 18, 1-6
38 Zwart, D. and Brocklesby, D.W. (1979) Babesiosis: resistance, immunology, pathogenesis. Adv. Parasitol. 17, 49-113
39 Reyers, F. et al. (1998) Canine babesiosis in South Africa: more than one disease. Does this serve as a model for falciparum malaria? Ann. Trop. Med. Parasitol. 92, 503-511
40 Malherbe, W.D. (1956) The manifestations and diagnosis of Babesia infections. Ann. N. Y Acad. Sci. 64, 128-146
41 Wlosniewski, A. et al. (1997) Etude du portage asymptomatique de Babesia canis en zone d'enzootie. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 20, 75-97
42 Graham-Smith, G.S. (1905) Canine piroplasmosis. III. Morbid anatomy. J. Hyg. 5, 250-267
43 Reusse, U. (1954) Zur klinik und pathologie der hunde-babesiose. Zeitschr. Tropenmed. Parasitol. 5, 451-469
44 Maegraith, B. et al. (1957) Pathological processes in Babesia canis infections. Z. Tropenmed. Parasitol. 8, 485-514
45 Guelfi, J.F. et al. (1984) Exploration de l'hemostase chez des chiens atteints de babesiose. Rev. Med. Vet. (Toulouse) 135, 699-703
46 Moore, D.J. and Williams, M.C. (1979) Disseminated intravascular coagulation: a complication ofBabesia canis infection in the dog. J. S. Afr. Vet. Assoc. 50, 265-275
47 Jacobson, L.S. et al. (2000) Blood pressure changes in dogs with babesiosis. J. S. Afr. Vet. Assoc. 71, 14-21
48 Jefferies, R. et al. (2003) Two species of canine Babesia in Australia: detection and characterization by PCR. J. Parasitol. 89, 409-412Matjila, P.T. et al. (2004) Confirmation of occurrence of Babesia canis 53 Kjemtrup, A.M. et al. (2000) There are at least three genetically vogeli in domestic dogs in South Africa. Vet. Parasitol. 122, 119-125 distinct small piroplasms from dogs. Int. J. Parasitol. 30, 1501-1505
49 Onishi, T. et al. (1990) Serum hemolytic activity in dogs infected with 54 Kuttler, K.L. (1988) World-wide impact of babesiosis. In Babesiosis of Babesia gibsoni. J. Parasitol. 76, 564-567 Domestic Animals and Man (Ristic, M., ed.), pp. 2-22, CRC Press
50 Wulansari, R. et al. (2003) Lymphocyte subsets and specific IgG 
51 55 Birkenheuer, A.J. et al. (2004) Detection and molecular characterization antibody levels in clindamycin-treated and untreated dogs exper- of a novel large Babesia species in a dog. Vet. Parasitol. 124,151-160 imentally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. 65, 579-584
52 56 Baneth, G. et al. (2004) Infection with a proposed new subspecies of
Zahler, M. et al. (2000) Detection of a new pathogenic Babesia microti Babesia canis, Babesia canis subsp. presentii, in domestic cats. J. Clin. like species in dogs. Vet. Parasitol. 89, 241-248 Microbiol. 42, 99-105